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  激的反响中山大学博士学位论文 0.44+0.14和0.49+0.09变应性鼻炎患者转录因子T-bet的表达特质及其对尘螨变应原体表里刺,(f=一2.324差别有统计学道理,029)P=0.。照组正在对,59+0.09该比值为0.,(P=O.000)明显高于上述两组。+1.34和25.58+17.22、5.99+2.44和13.53+5.41ECP(I-tg/m1)和CD23(%)水 公正在比照组和AR组分辨是4.67,于0.0lP 均幼。9、22.45+17.28和32.89+15.1 12.32+5.71和16.34+3.32、8.43+1.65和9.61+1.7042例纯正AR患者和团结有哮喘的18例AR患者的T.bet、ECP、 CD23和症状评分分辨是0.491-0.12和0.33+0.0,4、--3.407和一2.526f分辨是5.4ll、一2.22,030、0.001.和0.014各自P值分辨是0.000、0.。表此,有性别之间的差别上述4个目标没 。达强度与过敏症状无闭(T.betmRNA表,.214.=一0,101)P=0.。而然,和CD23存正在负相干闭联(T.bet 分辨与ECP,.292.=一0,.023P=O,.260产一0,045)P=0.。CD23之间存正在正相干过敏症状评分、ECP和,于0.05尸值均幼。IT后经S,f值分辨为4.633、6.036和10.798ECP 和CD23秤谌和症状评分均明显低落.(,0.01)P均幼 于。IT后经S,著上调(f=一2.324T.betmRNA表达显,029)P=0.。中T.bet表达阳性率高于非AR组正在AR组扁桃体、腺样体和鼻黏膜构造,计学道理差别有统,3.860和4.912f值分辨是4.038、,0.049和0.027P值分辨是0.044、;达分别岁数组之间存正在差别(AR组扁桃体T-bet表,079=7.,029)P=0.,t表达低于儿童组和青少年组个中 苛重是成年组T.be;et 表达没有岁数组之间的差别正在非AR组人群扁桃体构造T.b。中均有CD4和T.bet 表达两组中扁桃体、腺样体和鼻粘膜,达位于CD4+T细胞中大大都T.bet阳性表。和ECP秤谌高于非AR人群结论 1.AR患者CD23,MC 和NALT中的表达均下调然则T.bet正在AR患者的PB。者经SIT后2.AR患,和CD23以及ECP秤谌的低落可能看到T.bet表达的上调。度上反响了AR患者病情的告急水平CD23和ECP的秤谌正在肯定程。AR患者体例和限度粘膜免疫Thl反响 低下相闭3.Thl相干转录因子T.bet的下调表达与;应原体表反响低下T.bet对变,应 性鼻炎患者表周血单核细胞中正在尘螨特异性变应原体表刺激的变,不是由T.bet下调表达驱动的转录因子和细胞因子的Th2上风。表刺激的反响 中山大学博士学位论文 4.变应原正在体表诱导的Th2免疫反响1II 变应性鼻炎患者转录因子T—bet的表达特质及其对尘螨变应原体内,录因子T.bet介导的不是由Thl特异性转。秤谌的Thl上风获得厘正 来抵达Thl/Th2的失衡5.变应性鼻炎SIT的机理的新明白:起码是正在转录因子,相干转录因子的上调表 达介导的而这种形式是以Thl型特异性。应性炎症相闭又和NALT的效用形态相闭6.NALT中的T.bet表达既与变。变应性鼻炎闭头词: ;因子转录;应原变;调整免疫;spitalofSun Yaf.sen University Background ABSTRACT It has drawntheattentionof many researchersontherelationbetween many diseasesanddifferentiationofCD4 helper Tcellinrecent years.Under theconditionsof showing ofthefunctional heterogeneity ofTcell andeffectfromvarious cytokine免疫构造化学 IV 变应性鼻炎患者转录因子卜bet的表达特质及其对尘螨变应原体表里刺激的反响 中山大学博士学位论文 Transcription factorT-bet expressionpattern itsponse tostimulationofdust itsres 0nsetostimulationoldustmite allergeninvlvoandinvitro Major:Otorhinolaryngology M.D.Candidate:QuShen-hong Department:the First AffiliatedHo,ng cell antigenantigenpresenti,alanceofdifferentiationofThlfrh2involvesinmany diseases.For exampletheprecursorTh0cell selectively differentiate towards Th orTh2.Theb,lativeto Th2 drifthuman tumorsarere,ifferentiationof Thl/Th2 supports theoccurrenceofnewmethodsof immunotherapy. T—betand allergic diseases suchasasthmaalsorefertoTh2drift.Correctionoftheimbalance ofd,ated transcription factora new specific Thl-associ,onofThl/Th2hasbeenfocused. Without challenging from sensitinogenmainlyexpresses CD4+helpTcell.The important rolein differentiati,onistheover expression forthelossof inhibitionofTh2and its cytokine from T—betsole defect ofT bet Can cause airway inflammatory reactionin mousemode.Onereas,changing polarizedTh2 mayproduce conditionfortreatmentof allergic diseases. Th-associated transcription factors play importantroleonbalanceof cytokineand anotheristhedecreaseofTh1 andits cytokine forT—bet down regulation.That saythatTh2andits cytokines increased relatively.Cytokine mediated T—betand,reffectsoneventsaftercytokine stillunclear.Forexample变应性鼻炎患者转录因子T-bet的表达特质及其对尘螨变应原体表里刺激的反响中山大学博士学位论文 thei,associatedtranscription factorsis skin-deep.The expression Th—associatedtranscription factors nasopharyngeal—associatedlymphoid tissues(NALT)the relation between transcription factorsand eosinophil cationic protein(ECP)is unclear.The researchabout patterns allergen-stimulated onTh ,ral bloodofAR patients onthe aspects ofthe system immunity andlocalmucosal immunity.Our investigation istoview行om changesofTh l—associatedtranscription factors T.betsuch lymphoidtissues nasalmucosaneed investigationofthe mechanism developmentofARto research eelldifferentiation.associated transcription factorintheNALTand periphe,CPE,CD23and ,aR)patients. Objective Todetect transcription factorT—bet expression onPBMC anditsrelationswith CD23and theircorrelations allergen-stimulatedperipheralblood monouclear cells(PBMC)ofallergic rhinitis(,investigate changesthelevelofT—betmRNA expressionECP allergicsymptoms scoresin patients withAR.To ,23CD,spectively takenfrom15 healthy individualsand60 patients withARthattheir allergen Wasdust mite.ThePBMCof36AR patients werecultured andstimulated dustmiteallergen attheconcentrationof 5099/ml砌vitroECP allergicsymptomsscores ARpatients afterstimuluswithdustmite allergen vivoandinvitroaswellasthe pattern valueofT-betexpression inNALTof patients withandwithoutAR. Methods Blood samples were re。e transcriptase—P01ymerase chainreaction (]RT.PCR).The levelofCD19/CD23andECPwas respectively detected flowcytometry(FCM)andUnicapsystem beforeandaftercultureandSIT.T—betand CD4/T—bet expression adenoidsand 24AR patients receivedthe specific immunotherapy(SIT)/n vivowithstandarddustmite allergen forone year.PBMC fromtwo groups Was subj ectedto analysis ofT-bet mRNA expression usingsemiquaitative revers,nanddoublestain immunohistochemistry.Beforeandafter SIT forone yeartonsilsandnasalmucosawere respectively detected withthe single stai,ereevaluated. VI (户-2.324the nasal symptoms ofARw,control groupP=O.029).In ;was 0.59+0.09-.the ratio.,grofip andAR group 4.67毒1.34and25.58+17.22 and5.994-2.44 13.534-5.41which higherthan thatinthetwoaboveAR group睁0.ooo).The.1evel control,maandother18AR patients with如thmatic symptoms:the levelof T—betandtwoPvaluewerelowerthanO.01.Between42AR patients Without asth,494-0.12&0.324-0.08.22.454-17.28& 32.894-15.1lECP CD23and Symptoms scores respectively Was0.,&16.34+3.3212.324-5.71,&9.614-1.708.434-1.65,ingly respectivelyWas5.41 land th苦i‘xjalue’ correspond,224-2.,d 2.5263.407an,ingly respectivelyWas 0.000as wellasP value correspond,0300.,ionintensity ofT betmRNAhadnorelationto varying severity allergicsymptoms(F0.2 4o.001 thereWasnodifferenceofthosefouritemsabovebetweenfemaleandmale.’The express,.HoweverP=-0必威euro.100,relationwith ECPand CD23(产 0.292T—betrespectively hasa negative ,.023P=0;.260F-0,vecorrelation among ECPP=-0.045).There positi,uc.tion allergicsymptomsscores.afterSIT(f value respectively Was 4.633CD23 allergicsymptomsscores(allP<0.05).It indic..atedsignificant r.ed, 0.7985.1 13,nificantly up-regulated after SIT一2.324allP<0.oo.T—bet mRNA expression Was sig,oOfT—bet expression tonsils卢Q.029).. The pbSitive rati,ontrol group Was statisticallydifferent(=4.0384adenoidsandnasalmucosabetween‘、 AR group andc,8603.,9124.,=0.044and 尸,ntonsilsfromAR group inthreedifferent age groups=7.079’0.049:O.027).There iS differenceofT—bet expression i,s significantly‘lower than childrengroup adolescentgroupP=-0.029I thedifferenceis T.betexpression adultsgroup‘i;n differenceof agegroupsThere no’T—betexpressio。andmost positiveexpression ofT—betlocatedonCD4 positive cell. Conclusions 1.ThelevelofCD23 andECPinAR group Was higher thanthatinnon-AR groupin non—AR’ group.There weresome positiveexpression ofCD4andT-bet 变应性鼻炎患者转录因子T-bet的表达特质及其对尘螨变应原体表里刺激的反响中山大学博士学位论文 nasalmucosa fromtwo groups ,albloodofAR patients CanbeobservedafterSIT.ThelevelofCD23 andECPina way indicatedthe degree severityofAR patients’condition. The down-regulationexpression T-betbut theT-bet expression Was download-regulated inPBMCandNALTof patients AR.2.The download-regulated levelofECPandCD23and up—regulated T-bet expression peripher,h2 immune response specifictranscription factorT-betinvitro. It develops anewviewonSITofARthatThl predominance atleastonthelevelof transcription factorcorrects Thl/Th2 imbalancein wayofmediationof up—regulation ofThl—associated transcription factor. T-bet expression associatedwithallergic inflammationandfunctional statusofNAI.T. Key words: AllergicrhinitistheThl associated transcription factor Was responsible forthelower Thl response systemimmunity andlocalmucosal immunity ARpatients.T-bet showsno response stimulifrom allergen-stimulated invitro. TheTh2 predominance transcriptionfactor down-regulated T-bet expression inhousedust mite stimulatedPBMCof patients allergicrhinitis vitro.ItCan allergen-induced T;ion factorsTranscript;rgenAlle;therapyImmuno;学位论文 第一章尘螨变应原体表里刺激变应性鼻炎患者对转录 因子T-bet、ECP和CD23的影响 1幼引 尘螨是一种全国性的过敏原Immunohistochemistry 变应性鼻炎患者转录因子T-bet的表达特质及其对尘螨变应原体表里刺激的反响中山大学博士,个国度侦察结果:儿童失常反响性疾病80%的变应原是尘螨WHO于2005年7月8全国过敏日公布正在全全国32 。我国正在,喘爆发的苛重过敏原之一【11尘螨也是 惹起变应性鼻炎和哮。理状 态下的渗出物和粪便中尘螨抗原存正在于尘螨任何生,15%~20%占其总卵白的。ng的Der P【21每个微粒中含有0.1,室内正在,到30蚓g其浓度可达。O~20岬巨细因为其颗粒为l,呼 吸道黏膜很容易达到。落的皮屑为食品尘螨以人体脱,体物质含量极高床上螨及螨的解,生就躺正在床上人 从一出,必威英超,接触最早对螨的,内举动越多岁数越幼户,敏率 越高对螨的致。极化是近年来的钻探热门CD4+辅帮性T细胞的。效用上的异质 性Th细胞呈现为,递细胞及抗原等身分的感化下正在分别的细胞因子、抗原呈,向Thl或Th2细胞分裂Th0前体细胞遴选 性地。2、IFN-7、TNF.pThl细胞苛重渗出IL.,细胞的活化及迟发型超敏反响相闭与细胞介 导的免疫应答、巨噬。IL.6、IL.9、IL.10和IL.13Th2细胞苛重渗出IL.4、 IL.5、,进抗体的发生Th2细胞促,性粒细胞活化以及IgE的天生介导体液免疫、B 细胞和嗜酸。因子 的均衡及Thl或Th2的上风形态Thl/Th2细胞因子比值可反响细胞。2的均衡被突破一朝Thl胁,相 互遗失操纵两类细胞因子,或Th2占上风的漂移形态机体则处于Thl占上风。2的均衡 失调Thl/Th,免疫逃逸与肿瘤,物陶染有肯定的闭联细菌、病毒等微生,免疫性疾病和移植排斥反响的爆发并参予失常反 应性疾病、本身。失衡与多种疾病 相闭Thl/Th2分裂,规范的Th2漂移如肿瘤患者呈现,疾病呈现为Th2型哮喘等失常反响性,呈现为Thl型本身免疫疾病。管哮喘存正在相干性变应性鼻炎与支气,鼻炎伴有支气 管哮喘[31约20%~30%的变应性。的鼻黏膜的失常反响性炎症变应性鼻炎是Ig.E介导。应原体表里刺激的反响中山大学博士学位论文 导的疾病如变应性鼻炎中起紧要感化Th2细胞正在I班介 变应性鼻炎患者转录因子T-bet的表达特质及其对尘螨变。细胞因子Th2型,L.4囊括I,IL.13IL.5和,位限度天生增补正在变应性炎症部,均可检测 到增加的Th2型细胞因子正在肺泡支气管盥洗液和鼻腔渗出物中;可检测到 比平常人高的Th2细胞因子[4乃至正在变应性鼻炎和哮喘患者的表周血中也,5,16。细胞因子Thl型,2和IFN-7囊括IL.1,2型免疫反响可抑止 Th,于调整有帮。Th2细胞均衡校正Thl/,调整供给新的措施可为疾病的免疫。l/Th2细胞因子汇集怎样厘正失衡 的Th,常漂移逆转异,调整的新热门已成为免疫。相干转录因子GATA.3、 St必威现金回扣at6、c.Maf等正在Thl/Th2均衡中起紧要感化Thl发育特 异性相干转录因子如T-bet、Statl、Stat4和Th2发育特异性。相 闭转录因子拥有紧要道理.钻探Th细胞亚类的发育特异性。2000年哈佛大学Glimcher钻探幼组分 离出的新型转录因子【71个中T.bet(T.box expressed inT cell)是。CD4辅帮性T淋巴细胞T.bet苛重表达于, 相干转录因子是Thl特异性,ox基因家族是属于T.b,育中起紧要感化该家族正在胚胎发。义特质是一落后|后进序列的区域T.box基 因家族的定,box叫T.,基酸序列相对 应与落后|后进的200氨,DNA纠合域该序列是一。因位于11号染色体幼鼠Tbx21基,7号 染色体正在人位于1,0个氨基酸含有53,T.box纠合组织域个中189个氨基酸是。.bet氨基酸有88%的同源性人类的T—bet 与鼠类的T。细胞发生 的IFN-T和IL.12T.bet不只能使初始型的CD4T,h2及已齐备分裂的Th2 细胞逆转为Thl并且T.bet能将分裂中的Th2、效应性T,IFN吖发生跟随洪量的,IL.4并抑止,Th2型细胞 因子的发生IL.5/IL.1 3等,起的气道炎性病变【71从而减缓由细胞浸润引。的抑 造感化并不是直接的个中T.bet对IL.4,IL.4启动子的转录激活由于T.bet不行抑止,FN吖的过量表达也非依赖于 I,存正在于IFN-T受体缺失的环境下由于T.bet的这种抑止感化可,A.3感化互相拮抗T.bet与GAT,造是直接抑止GATA.3 基因T.bet抑止IL.4的大概机。表另,有分表明显的抑止感化T.bet对IL.5,GATA.3 调动的而IL.5也是直接有。化中起着闭头性的感化越来越受到闭心T-bet及其正在Thl/Th2分。刺激的环境下正在无致敏原 ,使幼鼠惹起气道炎症反响T-bet缺陷孤独就能,子遗失了T-bet的抑止后过量表达其一是由于Th2型 细胞及细胞因,l 分裂淘汰和Thl相干细胞因子淘汰其二是T-bet的表达缺陷导致Th,其细胞因子相对增加这也就导致Th2及。尘螨变应原体表里刺激的反响 中山大学博士学位论文 表此 变应性鼻炎患者转录因子T-bet的表达特质及其对,2细胞蜕变为调整过敏性疾病供给了要求T-bet介导细胞因子和已极化的Th。t大概是哮喘的候选基因比来的钻探说明T-be。达的 平常化和IFN吖反响相干过敏性喘鸣的缓解与T-bet表,低表达诱导的IFN吖天生淘汰这些说明T-betmRNA,重哮喘的紧要身分也许是他日爆发苛,诱导的Thl反响较低有告急哮喘患者尘瞒,缓解的却没有这些反响而那些哮喘症状获得。-bet多态性相闭【8J哮喘和气道高反响性与T。异性变 应原刺激培植后变应性鼻炎患者表周血特,TA.3被急迅上调【9】Th2相干转录因子GA。 疗自此是怎样蜕变的呢?它正在SIT厘正Thl/Th2的失衡中起的感化怎样?T-bet促 进Thl细胞发育而举动与GATA.3作 用相反的Thl相干转录因子T-bet正在受特异性变应原体表刺激和体内特异性免疫治,细胞因子的发生调动Thl型,影响呢?它对wECP和CD23等血清学目标的影响 还不睬解但它是否对变应性炎症爆发兴盛 流程细胞因子自此的下游事宜有。B细胞发生IgE由,E低亲协力受体CD23是Ig,反响闭 系亲昵它与炎症免疫,IgE中起紧要感化【l正在调动由B细胞发生的。合物推动 抗原呈递通过IgE抗原复,细胞效用【11】CD23可变化T,因 子的合成来调动免疫反响【l21正在体表它还可能通过影响T细胞细胞。中可看到受损 的IgE介导的免疫反响正在缺乏CD23的幼鼠变应性致敏模子,胞增加和气道高反响性可呈现气道嗜酸粒细。可调动针对过敏刺激的Th2反响的兴盛CD23不只 影响IgE发生j并且。及 其细胞因子有紧要影响T-bet‘对Thl细胞,是否发生影响还不睬解’对B细胞及其效用等。 B淋巴细胞中表达‘T—bet也正在,疫球卵白转换大概参加免。的目标CD23与T-bet的闭 系有帮于明白Th发育特异性相干转录因子对B细胞的影响和感化有学者把T-bet造作为B细胞性淋 巴瘤的诊断和分型的标识物[131o以是钻探与B细胞相干。bet与变应性鼻炎的闭联本钻探的宗旨是明白T-,短期体表刺激培植变应性鼻炎患者表周血通过用较大剂量的尘螨特异 性变应原,标的蜕变环境明白上述指;(圭臬化抗原)持久逐步体内刺激机体此表用幼剂量尘螨特异性变应原提取物,免疫调整即特异性,的蜕变并进一步考虑SIT的机造明白T-bet及相干血清学目标。及少许血清学目标是否受其调控:为钻探Thl/Th2均衡供给转录因子秤谌 的钻探材料明白两种刺激形式对这些目标的影响及其之间的差别:明白T-bet与变应原刺激的闭联以,疾病供给大概调整靶点和切入点为调整变应性鼻炎等失常反响性。山大学博士学位论文 2资料和本事 2.1病例材料和标本实行分组 75破例周血标本. 变应性鼻炎患者转录因子卜bet的表达特质及其对尘螨变应原体表里刺激的反响 中,8例男3,7例女3;--57岁岁数5一,28岁均匀。例采自强壮人个中15 ,比照举动,p CAP 体例检测变应原只为尘螨的变应性鼻炎患者另60例采自我院门诊或住院患者惯例承担Unica。R患者中60例A,患者 共15例5~13岁儿童,青少年患者20例14"--17岁,成人患者25例18岁及以上。应性鼻炎患者中上述60例变 ,括激素和抗组胺药)和免疫治 疗个中36例采血前未承担药物(包;尘螨的特异性免疫调整另24例为承担了针对,经达1年以上且调整时刻已,1年后两次选取其表周静脉血分辨于免疫调整前和免疫调整,者停用激素和抗组胺药物第二次采血前2周 嘱患。组见表2—1周详病例分。A变应性鼻炎的临床评估和分类圭臬【l4】诊疗圭臬依照2001年 WHO ARI。鼻炎的诊治法则和保举计划(2004年变应性鼻炎诊断及疗效圭臬参 照变应性,[15】兰州)。l Initiative forAsthma---GINA)哮喘诊断调整圭臬参 照2003环球哮喘防治创议(Globa。蒸馏水、无菌棉签、镊子、吸管、PRMI 1640培植液、 C02培植箱(Heraeus Germany)、24孔96孔板一次性培植瓶(Gibco USA)、淋巴 细胞离别液(中科院生化所)幼牛血清(PromegaUSA)、PHA(R&D公司usA)、 尘螨变应原(阿罗格德国)、1%台盼蓝、肝素、秋水仙素、氯化钾、甲醇、冰醋酸、 载玻片等表2—1病例分组 组别 团结哮喘比照组 15 AR组儿童组 青少年组 成人组 SIT组 螨刺激组 60 15 20 25 24 36 30 1312 18 30 ll12 12 18 18 ll2.2技巧途径一l 变应性鼻炎患者转录因子"r-bet的表达特质及其对尘螨变应原体表里刺激的反响中山大学博士学位论文 图2—1技巧途径%酒精、。组选取受试对象空肚表周静脉lfil.8ml2.3.2本事 2_3.2.1标本收罗 分。的血样标天职作 三份把每个受试对象每次,2ml一份,抗凝肝素,离别和培植betway刀塔用作淋巴细胞;5ml一份,kison SST试管中置于BeotonDic,:另逐一面lml作ECP检测用,K2201aL抗凝管中置于含10%EDTA,胞术检测用留作流式细。生存于4"C正在24h管理;理生存于一20赶上24h处。及其对尘螨变应原体表里刺激的反响 中山大学博士学位论文 2.3.2.2.1 抽取平常人静脉血加到肝素抗凝管中2.3.2.2用淋巴细胞离别液离别表周血中单个核细胞(PBMC) 变应性鼻炎患者转录因子卜bet的表达特质,肝素的无血 清缓冲液悬浮细胞加等量含5~10IU/ml。液等量的淋巴细胞离别液大将细胞悬液幼心加正在与血, 中室温,mp 20min秤谌离心500r。5层:最上面是血浆此时离心管中变成,离别液之间是PBMC血浆层和 淋巴细胞,的红细胞层之间是粒 细胞层淋巴细胞离别液层和最下面。2吸去最上层的血浆2.3.2.2.,离液接壤面的单个核细 胞收罗血浆层和淋巴细胞分,出PBMC尽量统共吸。灭活幼牛血清的Hanks 液(洗涤液)加1~2倍量含5IU/ml肝素、2%,mp 10rain混匀后离心200r,清液去上。同样洗涤液洗涤细胞2次2.3.2.2.3再用,xg10min每次离心500, 巴细胞离别液洗去残留的淋。力(应>95%)并计数细胞用1%台盼蓝染色检测细胞活。胞培植液将细胞配成得当浓度再用含 10%幼牛血清的细。常通,06~2x106pBMC每毫升表周血可得 1x1。2.3.2.3.1培植液配造无菌要求下配造培植液2.3.2.3 人表周血淋巴细胞变应原刺激培植 ,1ml 3%、肝素10u/ml 2%、尘螨变应原(501.tg/ml每瓶所含下列试剂:RPMI 1640、 幼牛血清10%、PHA 0.,ml培植瓶内分 装于10,l培植液每瓶5m,藏柜备用封口置冷。种:用2.5%碘酒、75%酒精消毒瓶盖2.3.2.3.2操作流程 11采样接,火焰过烤用酒精灯,BMC细胞液0.5~lml无菌要求 下取离别后的P,0滴足下每瓶加2,匀称轻摇,养物与瓶盖接触尽量避免培 ;:置362)培植。培植72幼时C培植箱中,足下轻摇1次每隔12幼时,胞滋长增殖以推动细 ;2幼时足下加秋水仙素3)造止瓜分:劳绩前,1.tg/ml培植液最终浓度为O.02,养箱中接续培植摇 匀后置培,正在瓜分中期以造止细胞。培植箱中取出培植瓶4)终止培植:从,ml尖底离心管中摇匀后移至10,集培植细胞尽量收 。pm8min2000r。理:弃上清液51低渗处,075MKCL8ml插手预温37的0.,打匀急忙,锅中10.20min置37 培植箱或水浴;低渗中尖底离心管61预固定:取出,et的表达特质及其对尘螨变应原体表里刺激的反响中山大学博士学位论文 酸混淆液轻轻插手新配造的1-2ml 3:2甲醇:冰乙 变应性鼻炎患者转录因子T-b,泡轻轻奏笑2-3下取相应编号滴管用汽。pm8-lOmin800-1000r;:弃上清液7)固定。醇冰乙酸混淆液10ml插手崭新配造的3:2甲,混匀轻打,0min以上封口置室温3。0rpmlomin1500-200,-3次再三2;水造备冰水片举行滴片8)造片:应用蒸馏。浸淀细胞留离心后,的固 定液加崭新配造,胞悬液造成细。 表2—2苛重仪器装备2.4 RT-PCR。s公司 日本SANYO公司ABl9600PCR扩增仪 美国ABI公司 斟TPSDEPC TriZol 氯仿、异丙醇等 M—MuLV逆转录酶 RYaseinhibitor 中山大学达安基因股份有限公司 上海生物工程有限公司 GIBCOBRL公司 广州化学试剂二厂 中山大学达安基因股份有限公司 大连宝生物工程有限公司 IB-actin 欧志英博士惠赠 RT-PCR试剂盒 大连宝生物公司 DNA分子量圭臬100 bp 上海生物工程有限公司 2.4.1.3引物 2.4.1.3.1 以T-bet(Pubmudline编号为模板).仪器装备名称 厂家开头 可调式移液器Finnpipette芬兰Labsystems:公司 造冰机、 日本SANYO公司 恒温水浴锅上海精宏实行装备有限公司 超净办事台 姑苏净修饰备公司 紫表分光光度计 日本岛津创造所 日本HITACHI公司台式高速离心思(TGL.16G) 上海安亭科学仪器厂 台式低温高速离机(Z323K) 德国HERMLE公司 DF-23B秤谌电泳仪 北京东方仪器厂 GDS7600凝胶扫描体例英国UVP公司 HZ.25气氛恒温振荡器 江苏太仓医疗仪器厂电子天平(BS210S) 日本Santoriu,tccacccggactc CC cgccaggaagtttcatttgggaaactaaagctcac aaacaacaagggggcgtccaacaatgtgacccaga taa gtaccagccccggctgcatatcgttgaggtgaacgacggagagccagaggcagcctgcaa cgcttccaacacgcatatct ttactttcca agaaacccagttcattgccgtgactgccta ccagaatgccgagattactcagctgaaaattgataataacccctttgccaaaggattccg ggagaactttgagtccatgtacacatctgttgacaccagc atcccctccc cgcctggacc caactgtcaattccttgggggagatcacta ctctcctctcctacccaacc agtatcctgt tcccagccgcttctaccccgaccttcctggccaggcgaaggatgtggttccccaggctta ctggctgggggccccccggg accacagcta tgaggctgagtttcgagcagtcagcatgaa gcctgcattcttgccctctgcccctgggcc accatgtaatactaccgaggccaggaggtcctggcacctggagctggctggcctgtggcaccccagtaccctcccaagatgggcccggc cagctggttc cgccctatgcggactctgcccatggaacccggccctggaggctcagaggg acggggaccagaggaccagggtccccccttggtgtggactgagattgcccccatccggcc ggaatccagtgattcaggactgggcgaaggagactctaagaggaggcgcgtgtcccccta tccttccagtggtgacagctcctcccctgctggggccccttctccttttgataaggaagc tgaaggacag ttttataactattttcccaa ctga 引物序列及宗旨片段的长度引物均由上海生工公司合成 2.4.1.3.2 T-bet基因序列全长及引物身分 61121 181 241 301 361 421 481 541 601 aggggcgggtcctcgacggctacgggaaggtgccagcccgccccggatgggcatcgtgga gccgggttgcggagacatgctgacgggcac cgagccgatgccggggagcgacgagggccg ggcgcctggc gccgacccgcagcaccgctacttctacccggagccgggcgcgcaggacgc ggacgagcgtcgcgggggcggcagcctggggtctccctacccggggggcgccttggtgcc cgccccgccg agccgcttccttggagcctacgcctacccgccgcgaccccaggcggccgg cttccccggcgcgggcgagtccttcccgcc gcccgcggacgccgagggctaccagccggg cgagggctac gccgccccggacccgcgcgccgggctctacccggggccgcgtgaggacta cgcgctacccgcgggactggaggtgtcggggaaactgagggtcgcgctca acaaccacct gttgtggtccaagtttaatcagcaccagac agagatgatcatcaccaagcagggacggcg gatgttcccattcctgtcat ttactgtggccgggctggagcccaccagccactacaggat gtttgtggacgtggtcttgg tggaccagcaccactggcggtaccagagcggcaagtgggt 变应性鼻炎患者转录因子T-bet的表达特质及其对尘螨变应原体表里刺激的反响中山大学博士学位论文 66l 72l 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1561 1621 2.4.1-3.3 gcagtgtggaaaggccgagggcagcatgccaggaaaccgcctgtacg,.2.1提取总KNA(注:以下设施所用的EP管、吸头都须为DEPC管理过的见表2—4 表2—4引物序列及宗旨片段的长度 2.4.2 实行本事 2.4,透风橱里举行且全流程正在,套举行戴手;bet的表达特质及其对尘螨变应原体表里刺激的反响中山大学博士学位论文 总RNA按Trizol Reagent仿单举行抽提细胞中 变应性鼻炎患者转录因子卜)

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